Genetisk analyse av skreitoktets eggsurvey 2022

På det årlige skreitoktet inngår systematisk sampling av egg med håvtrekk som en del av den faste overvåkingen. Egg blir sortert ombord med stereomikroskop, og egg som er klassifisert som gadoide egg med diameter 1.2-1.6 mm blir i videre databehandling antatt å være torskeegg. Det blir også observert andre gadoide fisk i området, og noe innblandig av andre arter kan ikke utelukkes. Etter skreitoktet i 2022 gjennomførte vi derfor en genetisk analyse for å undersøke innblanding av andre arter i håvtrekkene. Prøvene ble fiksert på sprit etter normal opparbeiding ombord, og senere genetisk analysert på laboratorium ved Havforskingsinstituttet sin stasjon i Flødevigen. Vi håper med det å avdekke eventuell innblanding av andre arter enn torsk (Gadus morhua). 2022 var et år med et moderat innsig av skrei til Lofoten og Vesterålen (Fuglebakk & Thorsen 2022). Vi regner derfor mulighetene for innblanding av andre gadoide egg som høy sammenlignet med tidligere år, og det er slikt sett et år som er godt egnet for å ettergå artsbestemmelsesprotokollen som blir brukt på toktet.

Egg ble samlet inn ombord på Johan Hjort under ordinært skreitokt i 2022. Håvtrekk utføres på skreitoktet i et fast rutenett med forskjellig tetthet i tre forskjellige strata, som vist i figur 1. Håvtrekk utføres med en T-80 egghåv med 375 µm maskevidde. Denne trekkes vertikalt gjennom de øverste 100 m av vannmassene med en vinsjhastighet på om lag 0,5 m/s. Når bunndypet er grunnere enn 105 m trekkes håven fra 5 m over bunn og opp til overflaten.

Protokoll for prøveopparbeiding og eggklassifisering ombord er beskrevet i interne kvalitetsdokument (Overvåkingstokt - skreitokt) og i de årlige toktrapportene (Fuglebakk & Thorsen 2022 ). I korthet var prosedyren som følger: Når håvtrekkene kom ombord ble prøven vurdert og deretter delt med planktondeler ut fra ønsket om at delprøven skulle inneholde mellom 100 og 200 egg (se vedlegg 1). Delprøven ble så opparbeidet levende under stereomikroskop; alle eggene ble plukket ut, deretter fotografert og til sist konservert på 96 % etanol for genetisk analyse. Bildene ble analysert ved hjelp av spesialutviklet billedanalyse programvare hvor hvert egg ble diametermålt samt type- og stadiebestemt. Alle gadoid lignende egg med diameter mellom 1.2 og 1.6 mm ble klassifisert som torskeegg.

De innsamlede eggprøvene ble tatt videre til genetisk analyse ved Lab Flødevigen. Utvalg av prøvene fra de ulike ønskede håvtrekk ble plukket ut tilfeldig og satt opp til DNA-ekstraksjon i 96-brønns plateformat på Hamilton Star robot. Det ble valgt ut 11 egg fra hver håv, bortsett fra håver med mer enn 500 egg, hvor 93 egg med utvalgt for genetisk analyse. For håver med mindre enn 11 egg ble alle egg genetisk analysert. Hver plate fikk to negative kontroller randomisert for å kvalitetssikre plateidentitet og orientering av platen i videre analyser. Kjemien og metoden for ekstraksjonen er levert av Omega Biotek (omegabiotek.com) og baseres på Mag-Bind® Blood and Tissue DNA HDQ.

Mag-Bind-teknologien isolerer DNA ut fra enzymatisk nedbrutte celler i løsning ved at små magnetiske kuler binder til seg DNA. Dette renses videre og separeres til slutt fra kulene og gir et DNA-ekstrakt. Konsentrasjon av DNA-ekstraktene ble videre målt ved hjelp av en fluorometrisk metode på en ThemoFisher Fluoroskan Microplate Fluorometer med Quan IT kit dsDNA High Sensitivity (0.2-50ng) (Ref Thermofisher Scientific)

Prøvene normaliseres til en konsentrasjon på <= 5 ng/µl for videre tilberedning av DNA-bibliotek for sekvensering. Den aktuelle sekvensen er en universell mini barcode 295 bp sekvens av det mitokondrielle COI (cytochrome c oxidase underenhet 1) utviklet for artsidentifisering av fisk av Sultana et al. (2018).

Bibliotekprepareringen skjer gjennom en todelt prosess, med to runder PCR. Ved PCR1 oppkopieres COI-fragmentet, og ved PCR2 merkes hver individuelle prøve med en barkode (i 5), samtidig som den får en indekskode (i 7) som representerer platen. Slik kan hver enkelt prøve identifiseres etter sekvensering. Biblioteksprepareringen gjøres med egne barkoder og indekser, som ikke er del av et kommersielt kit, men som tidligere er utviklet fra protokoll beskrevet i Campell et al. (2015).

Hvert DNA-bibliotek til sekvensering for artsidentifisering er sammensatt av fragmenter fra 16 plater, det vil si maksimum 1504 individuelle prøver og i tillegg 32 negative kontroller.

Biblioteket ble kvalitetskontrollert ved kjøring på en Agilent Bioanalyzer, som gir en profil av biblioteket ved gel elektroforese, og konsentrasjonsmålt på Qubit fluorometer (ThermoFisher Scienific). Sekvenseringen av biblioteket ble utført på en Illumina MiSeq, ved såkalt «paired end sequencing» med et MiSeq Reagent Kit v3 (150 bp) med bruk av 5% PhiX som kontroll.

Rådata fra sekvenseringen i fastq format ble behandlet i R (R Core Team 2021) med modulen DADA2 (Callahan et al. 2016). Kvalitetssikrede sekvenser ble deretter sammenliknet med en database bestående av COI sekvenser for gadoide fisk. Sammenlikningen ble gjort med R modulen rBLAST (Hahsler 2019). For suksessfull artsbestemmelse ble det forutsatt at et segment har minst 250 sammenhengde basepar som er sammenstilt med 100% likhet med et segment i databasen, og at dette forekommer for kun en enkelt art.

Genetisk analyse ble utført på et tilfeldig valgt sub-sample av de prøvene som var sortert ombord ved hjelp av mikroskopi. Noe forskjell i antall torskeegg identifisert med de to metodene må derfor påregnes som følge av tilfeldige samplingfeil. Vi kan estimere total antall torskeegg i mikroskopi-sorterte prøver i et håvtrekk ved:

hvor y er antall egg identifisert som torskeegg i genetisk analyse. n er antall egg i sub-sample til genetisk analyse, og N er totalt antall egg sortert ombord. Forventet samplingfeil er gitt ved standardfeilen:

Vi lar u betegne antall torske-egg identifisert ved mikroskopi, og regner ut absolutt forskjell mellom identifiseringsmetodene som:

For å få et innblikk i praktisk betydning av forskjeller i artsidentifiseringsmetodikk, kan vi estimere gjennomsnittlige håvfangster for romlige strata på bakgrunn av begge metodene. Vi behandler håvtrekkene som et tilfedig utvalg i hvert strata og regner gjennomsnittlig eggmengde pr håv i et strata som:

hvor h_i er antall torskeegg i håvtrekk i, estimert enten fra artssortering med mikroskopi eller genetikk. M er totalt antall håvtrekk i strata. Hvert enkelt håvtrekk dekker en forsvinnende liten andel av det totale arealet i hvert strata, og standardfeilen til gjennomsnittlig eggmentde kan estimeres som:

Vi ser da vekk fra samplingfeil som skriver seg fra sub-sampling av hvert håvtrekk (Se Delingsfaktor i Vedlegg 1).

3.1 - Artsbestemmelse

Grunnet naturlig variasjon i genfragmentet som ble analysert er det en viss risiko for feilklassifisering, og en viss risiko for at vi finner varianter av en art som ikke er belagt i databasen, og derfor ikke kan artsbestemmes. Som en kontroll på metodikken har vi derfor analysert sekvenslikhet mellom de forskjellige artene i databasen. Disse er oppsummert i Tabell 1. Med den genetiske variasjonen som er belagt i databasen er det kun mellom hyse og hvitting det er en viss forvekslingsfare med kriteriene vi bruker for genetisk bestemmelse. Den reelle variasjonen er naturlig nok større, men statistikken i tabell 1 viser likevel at torskesekvensene vi har analysert ikke kan forveksles med de 681 sekvensene fra 9 ulike arter torskefisk (Gadiformes) som vi har i databasen. Særlig ser vi at forvekslingsfaren mellom torsk og hyse er lav, med ingen like sekvenser funnet for 473*194 sammenlignede sekvenspar. Det er av interesse, fordi vi på forhånd regnet hyse som den viktigste forvekslingsarten i mikroskopiundersøkelsene.

De fleste eggene lot seg genetisk identifisere med protokollen beskrevet over. 373 av 1468 analyserte egg hadde ikke 100% treff på sekvens i databasen. Av disse hadde 321 mer enn 98% sekvenslikhet med øyepålindivider (Trisopterus esmarkii) i databasen. Disse uidentifiserte eggene er utelatt fra videre analyse. 834 egg ble identifisert som torskeegg, og kun 11 ble identifisert som hyse (Melanogrammus aeglefinus), som er den arten som vi på forhånd regnet som den som det er størst forvekslingsfare med ved mikroskopisk bestemmelse. Det lave antallet hyse-egg var et noe overraskende funn, da det ble funnet en del gytende hunn-hyse ved tråling under det samme toktet, og i overlappende toktområde på umiddelbart påfølgende tokt (se vedlegg 1 til Johannesen et al. 2022). Av de øvrige eggene var de fleste identifisert som sei (Pollachius virens, 247 egg) . For disse regner vi med liten forvekslingsfare med torskeegg ved mikropskiopisk bestemmelse ettersom diameteren typisk er noe mindre. Russel (1976) oppgir diameteren for seiegg til å være mellom 1.03 og 1.22 mm og torskeegg fra 1.16 til 1.89 mm. Imidlertid er vår erfaring fra mange eggtokt helt tilbake til 70-årene at skrei og kysttorsk i dette området gyter egg med diametere innenfor et mer snevert intervall, typisk mellom 1.2-1.6 mm. En viss overlapp med sei kan det imidlertid være, noe som også indikeres når man ser på størrelses fordelingen av egg fra toktet (Figur 2).

3.2 - Sammenligning

Figur 3 viser sammenligning av total estimert antall egg for hvert håvtrekk basert på enten artsidentifisering ved mikroskopi eller genetikk. Det overordnede bildet er et godt samsvar, foruten stasjonene i Austnesfjorden. Vi kan også merke oss at forskjell i eggmengde mellom håvtrekk later til å være vesentlig større enn forskjellen mellom artsbestemmelsesmetodene for samme håvtrekk. Dette indikerer at totalestimater fra toktet ikke vil være veldig sensitiv til hvilken artsbestemmelsesmetodikk som benyttes.

Som vist i tabell 2 er også gjennomsnittlig absolutt forskjell mellom antall torskeegg identifisert i samme størrelsesorden som forventet samplingfeil. Det tyder på at forskjellene er mindre enn eksperimentet er egnet til å demonstrere. Også her ser vi imidlertid et tydelig unntak for stasjonene i Austnesfjorden.

For å vise praktisk betydning av hvilken artsbestemmelsesmetodikk som blir brukt estimerer vi gjennomsnitlig eggmengde for hvert romlig stratum og bergener standardfeil. Denne beregningen inngår i beregning av eggindeksen, slik den er formulert i vedlegg til Fuglebakk & Thorsen (2022). Sammenligningen er vist i Figur 4.

Vi ser at forskjellen mellom artsbestemmelsesmetodikk er mindre enn omtrentlig ett standardavvik for alle områdene, igjen med unntak av Austnesfjorden. For en total eggmengdeindeks må det tas hensyn til at håvtrekkene ikke er utført med lik tetthet i de forskjellige områdene (Figur 2). Siden Austnesfjorden utgjør et svært lite areal bidrar den lite eggmengdeindeks for hele toktområde. En arealvektet bergening for hele toktområdet gir et gjennomsnitt på 53 +/- 5 torskeegg for genetikk, og 54 +/- 5 egg for mikroskopi. Vi regner at håven sampler et areal på ca 2 m², så dette tilsvarer mellom 20 og 30 egg pr. m².

3.3 - Austnesfjorden

Avvikene i Austnesfjorden skriver seg fra håvtrekkene med stasjonsnummer (CTD-nummer) 261, 262, 263, 264, og 265. Disse utgjør de fleste og innerste stasjonene i Austnesfjorden. I tabell 3 er det angitt noen nøkkeltall om prøveutvalget.

De fleste av disse stasjonene har altså blitt svært intensivt samplet for genetisk analyse, og det er ikke sannsynlig at forskjellene skyldes samplingfeil, i alle fall ikke for stasjonene 261, 262 eller 263. Figur 4 viser at artssammensetningen i disse prøvene i hovedsak er sei og ukjente arter. Eggene som her ikke er identifisert med 100% sekvenslikhet har 99% sekvenslikhet med øyepål. Vi forventer imidlertid liten grad av forveksling med torsk for både sei og øyepål. Det er mulig at avvikene kan forklares med forvekslingsarter som ikke er beskrevet i databasen vi har brukt for genetisk analyse. Dette kan ettergåes senere etterhvert som databasen utvides med nye data. Austnesfjorden har spesielle forhold sammenlignet med toktområdet forøvrig, og vi finner ofte relativt store mengder med egg i sene utviklingsstadier der. Det kan tilsi at tilknyttede gyteplasser er godt egnet for arter og bestander som har best oppvekstvilkår nært kysten.

Genetisk analyse av skreitoktets eggsurvey i 2022 viser at torskeegg er dominerende i håvtrekkene også i et år med et relativt lite innsig av gytetorsk fra Barentshavet. Analysen bekrefter også i hovedsak at protokollen for å identifisere torskeegg med mikroskopi fungerer tilfredstillende for beregning av eggmengdeindekser. Vi har ikke en fullgod forklaring på at en del stasjoner i Austnesfjorden avviker fra dette bildet (Figur 3 og 4), men dette har lite praktisk betydning for eggmengdebestemmelser for toktområdet som helhet. Vi var også litt overrasket over at vi ikke fant mer hyseegg, ettersom vi gytende hyse er observert i trålhal i Vestfjorden på denne tiden. Vi har heller ikke en fullgod forklaring på det, men har kontrollert mot et rikt utvalg av hysesekvenser i genetikkdatabasen.

Feil i artsbestemmelse later til å være av en størrelsesorden som er mindre enn samplingfeil (Figur 4, Tabell 2), og slik ikke av betydning for fortolkning av indeksen. Vi føler oss betrygget på at artssortering med mikroskopi er en kostnadseffektiv metode for å opparbeide en pålitelig eggmengdeindeks. Artsbestemmelse med mikroskopi er likevel prisgitt forholdene i havet, slik som mengde av forvekslingsarter i området, og deres gytetidspunkt. Begge disse forholdene kan være gjenstand for endring over tid. Eksperimentet kan derfor med fordel gjentas om noen år, og mulighetene for å gjennomføre rutinemessig genetisk analyse bør fortløpende vurderes mot kostnad.

Fuglebakk, Edvin og Thorsen, Anders. 2022. Skreitokt 2022. Toktrapport 2022-10 ISSN: 1503-6294 (https://www.hi.no/hi/nettrapporter/toktrapport-2022-10)

Fra Havforskningsinstituttets Kvalitetsportal (intern): «Overvåkningstokt – Skreitokt» (https://hi.dkhosting.no/docs/pub/DOK06743.pdf)

Sultana, Sharmin, Md. Eaqub Ali, M.A. Motalib Hossain, Asing, Nina Naquiah, og I.S.M. Zaidul. Universal Mini COI Barcode for the Identification of Fish Species in Processed Products’. Food Research International 105 (March 2018): 19–28.
(https://doi.org/10.1016/j.foodres.2017.10.065)

Campbell, Nathan R., Stephanie A. Harmon, og Shawn R. Narum. ‘Genotyping‐in‐Thousands by Sequencing (GT‐seq): A Cost Effective SNP Genotyping Method Based on Custom Amplicon Sequencing’. Molecular Ecology Resources 15, no. 4 (July 2015): 855–67.
(https://doi.org/10.1111/1755-0998.12357)

R Core Team (2021). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria.
(https://www.R-project.org/)

Callahan, B., McMurdie, P., Rosen, M. et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods 13, 581–583 (2016).
(https://doi.org/10.1038/nmeth.3869)

Hahsler M, Nagar A (2019). rBLAST: R Interface for the Basic Local Alignment Search Tool. R package version 0.99.2.
(https://github.com/mhahsler/rBLAST)

Russel, F. S.1976. The Eggs and Planktonic Stages of British Marine Fishes, Academic Press, London - New York - San Francisco.

Johannesen, Edda; Gabrielsen, Heidi; Frøysa, Håvard Guldbrandsen; Holm, Else; Husebø, Åse; Pedersen, Ronald; Petersen Marianne; og Seim, Silje Elisabeth. 2022. Gytefeltskartlegging Nordøstarktisk hyse Toktnummer 2022609. Toktrapport 2022-8 ISSN: 1503-6294
(https://www.hi.no/hi/nettrapporter/toktrapport-2022-8)

Tabellen viser oversikt over håvtrekk på ordinært tokt (stasjoner fra snitt er utelatt). Torske-egg er antall egg bestemt til å være torsk ved mikroskopi. Total egg er totalt antall egg i prøven som ble undersøkt. Delingsfaktor angir hvor stor andel denne prøven utgjør en av alle eggene i håvtrekket. Betegnelsene u og N refererer til variable i avsnittet «Metode».

Tabellen viser resultat av genetikk utført på ordinære håvtrekk i skreitoktet. Noen få stasjoner fra snitt ble også analysert, men er ikke inkludert i tabellen. Betegnelsen n refererer til variable i avsnittet «Metode».